Mejoramiento de la producción de Royalactina (MRJP1) en Pichia pastoris, mediante generación de una cepa sobreproductora y su cultivo en biorreactor

Abstract

La proteína MRJP1 (del inglés Major Royal Jelly Protein 1) mejor conocida como Royalactina (RY) tiene potencial para su explotación en la industria farmacéutica, utilizado como agente hepático-protector, factor estimulante de eritropoyesis, adyuvante para reducir los niveles de colesterol en sangre. En trabajos anteriores se han propuesto diferentes modelos para la expresión de MRJP1, sin embargo, ninguno ha sido idóneo para la producción a escala piloto debido a títulos y rendimientos bajos. El presente trabajo tiene como objetivo aumentar la expresión de la proteína RY en Pichia pastoris, incrementando el número de copias del gen ry, mejorando las condiciones del cultivo en la fase de producción y cultivo en fed-batch en biorreactor. Resultados. Se realizó la construcción de dos diferentes plásmidos para la expresión de RY, uno bajo el control del promotor pAOX1 (inducible con metanol) y un segundo con una versión mejorada del promotor pPPGAP (inducible con glucosa). Los plásmidos se transformaron de forma independiente a una comercial de P. pastoris. Se realizó el fenómeno de hiperresistencia para aumentar el número de copias de RY integradas al genoma de Pichia, al final del proceso se obtuvieron 119 candidatas productoras. Todas las candidatas fueron evaluadas mediante cinéticas realizadas en microplaca. Al final del proceso se obtuvieron 14 cepas sobreproductoras (10 bajo el promotor pAOX1 y 4 con el promotor pPPGAP. Estas cepas productoras se evaluaron en matraces en medio complejo. De las cepas evaluadas se encontró que la cepa G3-5 (portando el promotor pPPGAP) presentaba el mejor rendimiento de producción de RY, cerca de 0.5 g L-1 Posteriormente se llevaron a cabo estudios de mejoramiento de condiciones de cultivo, donde se evaluaron tres medios diferentes y dos temperaturas diferentes para la fase de expresión (25 y 30ºC). Los resultados muestran que se alcanzan rendimientos superiores en medio mineral y 25 ºC con un título final de 1.2 g L -1 . Conclusiones. Se ha generado y caracterizado una cepa de P. pastoris cuyo título y rendimiento son los más altos reportados para la producción recombinante de Royalactina. Dados los parámetros cinticos y de producción de la cepa es una candidata adecuada para futuros trabajos de escalamiento y optimización del bioproceso.