Análisis estructural y conformacional de péptidos derivados de la proteína HSP60 como moduladores del complejo TLR4/MD2: Una aproximación In silico e In vitro

Las enfermedades cardiovasculares (CVD, por sus siglas en inglés), representan uno de los mayores retos para la sociedad debido a su alta incidencia y mortandad, siendo consideradas la principal causa de muerte en el mundo, con una estable tendencia al alza, a pesar de los avances en tratamientos médicos. La etiología de las CVD es diversa, con múltiples estímulos capaces de inducir efectos deletéreos en el sistema cardiovascular, tales como la inducción de la remodelación tisular, la generación de estrés oxidante, la disfunción endotelial y la activación de respuestas inflamatorias. El tejido endotelial, presente en la capa interna de la vasculatura, ha sido reconocido como un órgano paracrino debido a su capacidad de regulación procesos celulares como la angiogénesis, la hemostasia y la modulación de respuestas inflamatorias a partir de la producción de moléculas mensajeras como el óxido nítrico (NO, por sus siglas en inglés) y la secreción de moléculas de señalización, como las citocinas. El tejido endotelial expresa diversos receptores celulares de manera basal, tales como la familia de los receptores de tipo toll (TLR, por sus siglas en inglés), los receptores de tipo NOD (NLR, por sus siglas en inglés), receptores RIG-1 (RLR, por sus siglas en inglés) y los receptores de lectina tipo C (CLR, por sus siglas en inglés), los TLR destacan por su abundancia y sensibilidad en la inducción de expresión en el endotelio. Dentro de la familia TLR, destaca el receptor TLR4, por abundancia en la expresión basal y a su sobreexpresión en condiciones patológicas e.g., CVD. El receptor TLR4 es el encargado de detectar diversos DAMPS e.g., moléculas endógenas deslocalizadas o liberadas de la célula como la proteína de choque térmico 60 (HSP60, por sus siglas en inglés) y de PAMPS, como oligosacáridos y lipopolisacáridos (LPS), siendo este último su activador por excelencia. La proteína HSP60, es una proteína chaperona conservada evolutivamente, con la cual se ha visto una asociación con el desarrollo de respuestas inflamatorias en enfermedades CVD, sobre todo cuando ésta es detectada en circulación por medio del complejo TLR4/MD2. A pesar de contar con un potencial en el desarrollo de moduladores del TLR4, a la fecha, no existen estructuras cristalográficas del complejo TLR4/MD2 ligado a la proteína HSP60 o péptidos derivados de la misma, lo cual limita en gran medida la comprensión del efecto estructural de los mismos sobre el receptor. Sin embargo, en la actualidad, con el aumento en el poder computacional y el desarrollo de técnicas bioinformáticas como el acoplamiento molecular (molecular docking) y la dinámica molecular (molecular dynamics), se han logrado analizar atomísticamente estructuras proteicas y proponer modelos teóricos de interacción entre un ligando y una proteína. basados en las leyes de newton del movimiento y en mecánica estadística. Para ese proyecto de tesis, se desarrolló una primera aproximación in silico de los efectos conformacionales de 2 péptidos de 15 aminoácidos de longitud derivados de la proteína HSP60 en el complejo receptor TLR4/MD2. Para esto, se partió del análisis estructural por medio de molecular dynamics, de la versión dimérica del TLR4/MD2 en ausencia y presencia de agonistas y antagonistas canónicos, LPS y lípido IVa, respectivamente, permitiendo tener una referencia estructural del efecto asociado a cada ligando. Posteriormente, se evaluaron los efectos del acoplamiento por molecular docking, previamente determinado en el grupo de investigación, en la estructura del receptor TLR4/MD2 por la técnica de molecular dynamics. A partir de lo obtenido en la versión dimérica del complejo TLR4/MD2, se procedió a evaluar el efecto de los controles y del acoplamiento de los péptidos, en la versión tetramérica del complejo TLR4/MD2 (TLR4/MD2-TLR4/MD2), la cual se asocia biológicamente a una activación de la cascada de señalización proinflamatoria. A partir de los análisis del tetrámero, se identificaron efectos estructurales presentes en el complejo receptor y se identificaron, evaluaron interacciones intracelulares presentes entre el ligando de interés con la subunidad MD2, del complejo TLR4/MD2, y se compararon con lo reportado en literatura. Con el fin de determinar si los resultados in silico mostrarían un comportamiento funcional in vitro, se realizaron análisis de actividad metabólica por medio de la prueba de azul de Alamar, utilizando tratamientos a concentraciones de 100 ng/mL y 1000 ng/mL por 24 horas de LPS, péptido 2 y péptido 4, con el fin de activar los potenciales mecanismos moduladores del complejo TLR4/MD2. Los resultados preliminares mostraron que con dichas concentraciones no se afectó la viabilidad celular. Concluyendo la evaluación in vitro, se evaluó el efecto de los tratamientos experimentales, a 100 ng/mL y 1000 ng/mL por 24 horas con el objetivo de determinar la presencia de citocinas proinflamatorias producto de la activación del complejo TLR4/MD2. Los resultados del perfil de expresión de citocinas mostraron un nivel de expresión diferencial en los tratamientos respecto al control.

https://orcid.org/0000-0002-5001-0093